- Аннотация Гипергликемия и гиперинсулинемия ускоряют старение и рак. Антидиабетические бигуаниды,...
- РЕЗУЛЬТАТЫ
- Возрастная динамика потребления пищи и воды
- Возрастная динамика эстральной функции у мышей
- Таблица 1.
- Возрастная динамика температуры тела у мышей
- Влияние метформина на метаболические и гормональные показатели у мышей
- Таблица 2.
- Выживание и долголетие самок мышей SHR
- Таблица 3
- Развитие спонтанных опухолей у самок мышей SHR
- Таблица 4
- ОБСУЖДЕНИЕ
- МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
- Экспериментальная конструкция
- Метаболические и гормональные тесты
- Патоморфологическое обследование
- Статистика
Аннотация
Гипергликемия и гиперинсулинемия ускоряют старение и рак. Антидиабетические бигуаниды, такие как метформин, снижают уровень глюкозы, инсулина и IGF-1. Метформин увеличивает продолжительность жизни и предотвращает рак у мышей, хотя его действие варьируется в зависимости от штамма мышей и пола. Здесь мы показали, что хроническое лечение беспородных мышей SHR с метформином, начатое в возрасте 3, 9 или 15 месяцев, привело к снижению температуры тела и отложило возрастное отключение эстральной функции. Удивительно, что метформин не влиял на уровень сывороточного холестерина, триглицеридов, глюкозы и инсулина. Лечение метформином, начатое в возрасте 3 месяцев, увеличило среднюю продолжительность жизни на 14% и максимальную продолжительность жизни на 1 месяц. Лечение, начатое в возрасте 9 месяцев, незначительно увеличило среднюю продолжительность жизни всего на 6%, тогда как лечение, начатое в возрасте 15 месяцев, не увеличило продолжительность жизни. Средняя продолжительность жизни мышей без опухолей была увеличена на 21% в «самой молодой группе», на 7% в «группе среднего возраста» и, напротив, была снижена на 13% в «самой старой группе». Когда метформин начинался в возрасте 3 и 9 месяцев, он задерживал первое обнаружение опухоли на 22% и 25% соответственно. Таким образом, у самок мышей SHR метформин увеличивал продолжительность жизни и откладывал опухоли, когда начинал в молодом и среднем возрасте, но не в старости. В отличие от этого, метформин улучшает репродуктивную функцию, когда начинается в любом возрасте.
Ключевые слова: метформин, возраст инициации, биомаркеры старения, продление жизни, спонтанный канцерогенез, мыши
ВСТУПЛЕНИЕ
Потенциальная связь между старением и передачей сигналов инсулин / IGF-1 привлекает значительное внимание в последние годы. Об этой связи свидетельствует увеличение частоты инсулинорезистентности и диабета 2 типа при синдромах ускоренного старения у людей, с одной стороны, а также увеличение продолжительности жизни из-за ограничения калорийности (CR) у грызунов, с другой стороны. Сопутствующее снижение уровня инсулина в плазме и уровня глюкозы в плазме, что предполагает повышенную чувствительность к инсулину, становится признаком увеличения продолжительности жизни [ 1 ]. Гипергликемия является важным фактором старения, участвующим в генерации прогрессивных конечных продуктов гликозилирования (AGE) [ 2 ]. Существует доказательство того, что гиперинсулинемия способствует накоплению окисленных белков [ 2 ]. Необработанные диабетики с повышенным уровнем глюкозы страдают от многих проявлений ускоренного старения, таких как нарушение заживления ран, ожирение, катаракта, сосудистые и микрососудистые повреждения [ 3 ]. Важно подчеркнуть, что гиперинсулинемия является важным фактором не только в старении, но и в развитии рака [ 3 - 5 ].
Концепция миметиков CR в настоящее время интенсивно исследуется [ 6 , 7 ]. Миметики CR включают вмешательства, которые производят физиологические и омолаживающие эффекты, подобные CR. Было предложено использовать антидиабетические бигуаниды в качестве потенциального средства против старения [ 3 , 10 - 14 ]. Было обнаружено, что противодиабетические препараты фенформин и буформин снижают гипергликемию и дают следующие эффекты: улучшенное использование глюкозы, снижение использования свободных жирных кислот, глюконеогенез, липиды сыворотки, инсулин и IGF-1, а также снижение массы тела как у людей (включая рак) пациенты) и экспериментальные животные [ 3 , 15 - 17 ]. Имеются данные о геропротекторном и антиканцерогенном потенциале метформина [ 11 , 17 - 21 ]. Следует отметить, что во всех экспериментах, связанных с изучением потенциального геропротекторного действия, лечение метформином было начато в молодом возрасте. В то же время возможность успешного лечения геропротекторами, начатыми в среднем или пожилом возрасте, очень привлекательна [ 22 ]. Существуют данные, которые приписывают некоторые эффекты различия в отношении ограничения калорийности или других геропротекторов в зависимости от стадии онтогенеза, когда воздействие началось, и от продолжительности последнего [ 22 , 23 ].
В этой статье мы представляем результаты лечения антидиабетическим бигуанидом метформином, которое было начато в возрасте 3, 9 или 15 месяцев у самок беспородных мышей SHR.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Возрастная динамика массы тела
Масса тела мышей в контрольной и обработанной метформином группах увеличивалась с возрастом, превышая на 16 месяцев массу тела 3-месячных животных на 34,31%. Не было никакой разницы в средней массе тела мышей, подвергавшихся воздействию и не подвергавшихся воздействию лекарственного средства, до возраста 20 месяцев, и тенденция к уменьшению массы тела наблюдалась в группах, получавших метформин, после этого возраста ().
Возрастная динамика массы тела ( A ), потребления пищи ( B ), температуры тела ( C) и заболеваемости мышей с нерегулярными эстральными циклами ( D ) у мышей SHR, которых не лечили и не лечили метформином, начиная с возраста 3 лет. 9 или 15 месяцев. Разница с контролем достоверна, р <0,05: а-метформин 3 м; б - метформин 9 м; с - метформин 15 м)
Возрастная динамика потребления пищи и воды
Количество пищи, ежедневно потребляемой мышами в течение периода наблюдения, было одинаковым в контрольной группе и в группах, получавших метформин (). Количество воды, потребляемой мышами, изменялось в течение периода наблюдения и было практически одинаковым во всех группах (данные не показаны).
Возрастная динамика эстральной функции у мышей
Продолжительность эстральных циклов у контрольных самок мышей SHR с возрастом существенно не изменялась, тогда как в разном возрасте у мышей, подвергшихся воздействию метформина, с 3, 9 или 15 месяцев она значительно снижалась по сравнению с состоянием эстрального цикла у контролей. соответствующего возраста (). Доля мышей с нерегулярными эстральными циклами увеличивалась с возрастом у контрольных мышей, но не у мышей, получавших метформин, до возраста 15 месяцев (,), независимо от времени начала лечения метформином.
Таблица 1.
Влияние метформина в разном возрасте на возрастную динамику эстральных функциональных показателей у мышей SHR.
Возраст, месяцев Число мышей Длина эстрального цикла, дни Частота эстральных циклов различной длины,% Фракция мышей с регулярными циклами,% <5 дней 5-7 дней> 7 дней Контроль 3 30 6,9 ± 0,28 0 64 36 81 7 29 8,1 ± 0,46 0 44 56 56 11 36 7,5 ± 0,50 0 44 56 50 14-15 24 7,4 ± 0,56 0 71 29 29 18 23 8,1 ± 0,56 0 33 67 39 21 21 8,0 ± 0,49 0 25 75 19 Метформин, 3 месяцев 3 33 7,1 ± 0,26 0 64 36 92 7 32 6,5 ± 0,24 ** 3 74 * 23 * 92,5 *** 11 30 6,2 ± 0,31 * 27 50 23 * 84 ** 14-15 24 6,4 ± 0,34 3, 7 81,5 14,8 87 ** 18 20 7,7 ± 0,52 0 40 60 50 21 14 6,5 ± 0,37 * 0 75 25 43 Метформин, 9 месяцев 11 32 6,1 ± 0,30 * 22 56 22 * 80 ** 14-15 29 6,6 ± 0,32 7 76 17 81 ** 18 22 7,7 ± 0,41 0 50 50 50 21 12 7,7 ± 1,37 0 67 33 25 Метформин, 15 месяцев 18 19 7,6 ± 0,37 0 50 50 42 21 13 6,4 ± 0,50 * 0 87 * 13 * 54 *
Возрастная динамика температуры тела у мышей
У контрольных мышей не было значимых возрастных изменений средней температуры тела. Лечение метформином, начатое в возрасте 3 месяцев, снизило температуру тела в возрасте 15 месяцев по сравнению с контрольной группой того же возраста. Кроме того, температура тела была снижена между 11-м и 18-м месяцами жизни у мышей, получавших препарат с 9-месячного возраста. Введение метформина, начатое в возрасте 15 месяцев, не влияло на среднюю температуру тела у мышей ().
Влияние метформина на метаболические и гормональные показатели у мышей
Лечение метформином, начатое в возрасте 3, 9 или 15 месяцев, не давало влияния на уровни глюкозы, общего холестерина, триглицеридов и инсулина в сыворотке, оцененные, когда мышам было 16,5 месяцев ().
Таблица 2.
Влияние метформина на метаболические параметры у самок мышей 16,5 месяцев
Лечение Возраст в начале лечения метформином Глюкоза, ммоль / л Общий холестерин, ммоль / л Триглицериды, ммоль / л Инсулин, мк ед / мл Контроль - 7,3 ± 1,50 2,9 ± 1,06 1,5 ± 0,46 0,17 ± 0,12 Метформин 3 месяца 8,1 ± 0,64 2,7 ± 0,37 1,0 ± 0,03 0,49 ± 0,47 9 месяцев 7,9 ± 0,59 2,5 ± 0,27 0,9 ± 0,22 0,06 ± 0,05 15 месяцев 7,8 ± 0,78 2,6 ± 0,21 1,1 ± 0,08 0,19 ± 0,18
Выживание и долголетие самок мышей SHR
Лечение метформином, начатое в возрасте 3 месяцев, сдвинуто вправо по кривой выживания по сравнению с контролем (). Эффект лечения, начатый в возрасте 9 месяцев, был менее выраженным () и отсутствовал в группе, где метформин начинался в старшем возрасте (). Согласно логарифмическому критерию разница в выживаемости самок мышей SHR, подвергшихся лечению метформином с возраста 3, 9 или 15 месяцев, по сравнению с контрольными группами соответствующего возраста, незначительна (значение p составляет 0,181; 0,97 и 0,478 соответственно). Согласно оценочным параметрам регрессии Кокса, лечение метформином, начатое в возрасте 3 месяцев, уменьшило относительный риск смерти по сравнению с контрольной группой (β = -0,227; exp (β = 0,797; se (β) = 0,169; р = 0,173) Лечение метформином, начатое в возрасте 9 или 15 месяцев, не оказало влияния на относительный риск смерти у самок мышей SHR по сравнению с контрольной группой.
Кривые выживания и кривые выхода опухоли у самок мышей SHR, которых не лечили и не лечили метформином, начинают в возрасте 3 ( A, B ), 9 ( C, D ) или 15 месяцев ( E, F ).
Различия в выживаемости были отражены в показателях долголетия. Лечение метформином, начатое в возрасте 3 или 9 месяцев, увеличило среднюю продолжительность жизни (+ 14,1% и 6,1%, соответственно, р> 0,05), медиана на 17,5% и 6,6%, соответственно, но практически не повлияло на начало в возрасте 15 месяцев. Максимальная продолжительность жизни была увеличена на 1 месяц только у мышей, которых лечили с самого раннего возраста (). Стоит отметить, что средняя продолжительность жизни у мышей без опухолей увеличилась на 20,7% в группе «самый молодой возраст», на + 7,1% в группе «средний возраст начала» и сократилась на 12,8% в старость началась 'группа. Параметр α модели Гомперца был выше в 1,4 раза в группе, получавшей лечение метформином с 3-месячного возраста, и в 1,9 раза в группе среднего возраста, по сравнению с контрольной группой (р <0,05). В то же время она была несколько снижена в пожилом возрасте начатой группе, получавшей метформин. Разница между контролем и этой последней группой была статистически значимой ().
Таблица 3
Влияние метформина, полученного в разном возрасте, на продолжительность жизни самок мышей SHR
Параметры Контроль-3 MF-3 Контроль-9 MF-9 Контроль-15 MF-15 Количество мышей в начале лечения 119 51 97 45 69 33 Средняя продолжительность жизни, дни 511 ± 20,3 583 ± 26,7 (+ 14,1%) 583 ± 17,9 619 ± 19,5 (+ 6,2%) 668 ± 15,7 647 ± 21,4 Медиана, дни 525 617 591 630 636 636 Средняя продолжительность жизни последних 10%, дни 881 ± 12,8 897 ± 27,8 892 ± 12,4 820 ± 14,1 913 ± 8,8 892 ± 47,0 Максимальная продолжительность жизни, дни 941 972 941 855 941 966 α × 103, дни − 1 3,7 (3,2; 3,9) 5,2 * (4,9; 5,3) 4,1 (3,9; 4,2) 7,8 * (7,7; 8,2) 4,7 (4,6 ; 4,8) 4,3 * (4,2; 4,5) MRDT, дни 187 (178; 217) 133 * (131; 141) 169 (165; 178) 89 * (85; 90) 147 (144; 151) 161 * (154; 165) Количество мышей без опухолей 62 25 45 15 29 16 Средняя продолжительность жизни мышей без опухолей, дни 478 ± 32,7 577 ± 44,3 (+ 20,7%) 609 ± 29,7 652 ± 31,5 (+ 7,1%) 719 ± 23,9 627 ± 25,5 * (−12,8%)
Развитие спонтанных опухолей у самок мышей SHR
В соответствии с долгосрочным тестом не было значимых различий в возрастных распределениях общего числа опухолей в контрольной и обработанной метформином группах (). Первые опухоль-несущие мыши (злокачественные лимфомы) умерли в возрасте 246 дней в контрольной группе и на 300-й день (+ 22%) в группе мышей, получавших метформин, начиная с 3 мес, а на 363-й день ( + 24,7%) в группе, получавшей метформин, начиная со среднего возраста и на 482-й день (+ 5,2%) в самой старой группе, получавшей метформин, по сравнению с контрольной группой соответствующего возраста (). Средняя продолжительность жизни мышей с опухолями была сходной, увеличиваясь на 7,9%, 7,3% и 5,4% в группах, получавших метформин, в возрасте 3, 9 и 15 месяцев соответственно.
Таблица 4
Влияние метформина, полученного в разном возрасте, на самопроизвольное развитие опухоли у самок мышей SHR
Параметры Control-3 MF-3 Control-9 MF-9 Control-15 MF-15 Эффективное количество мышей 103 48 97 45 69 33 Возраст смерти 1-го TBM 246 300 291 363 458 482 Количество TBMb (%) 57 (55,3%) 26 (54,2%) 54 (55,7%) 30 (66,7%) 40 (58,0%) 17 (51,5%) Общее количество опухолей 60 26 57 31 43 18 Количество опухолей на TBM 1,05 1,00 1,06 1,03 1,08 1,06 Количество злокачественных ТБМ (%) 54 (49,5%) 26 (54,2%) 51 (52,6%) 27 (60,0%) 37 (53,6%) 16 (48,5%) Средняя продолжительность жизни ТБМ, дни 547 ± 22,2 590 ± 31,3 (+ 7,9%) 562 ± 21,5 603 ± 24,4 (+ 7,3%) 631 ± 18,9 665 ± 34,1 (+ 5,4%) Локализация и тип опухолей Аденокарцинома молочной железы 42 (40,8%) 23 (47,9%) 40 (41,2%) 20 (44,4%) 27 (39,1%) 12 (36,4%) Лейкемия / лимфома 7 (6,8%) 2 (4,2%) 6 (6,2%) 3 (6,7%) 6 (8,7%) 3 (9,1%) Яичник: гемангиома
гранулезная клеточная опухоль
аденокарцинома 1
1
1 -
-
1 1
1
1 -
-
2 1
1
1 -
-
- печень: холангиокарцинома 2 - 2 - 2 - легкое: аденома
аденокарцинома 1
3 -
- 1
3 2
2 1
3 1
- Кожа: папиллома
фибросаркома 1
- -
- 1
- 1
- 1
- -
1 Мягкие ткани: саркома - - - - - 1 Utery: гемангиома - - - 1 - - Селезенка: гемангиома 1 - 1 - 1 -
Общая заболеваемость опухолью у «эффективных» контрольных самок мышей (выживших к моменту смерти от первой опухоли в эксперименте) была практически одинаковой во всех группах, получавших метформин и в контрольной группе (). Карциномы молочной железы и лейкемия развивались наиболее часто в соответствии с онкологическими характеристиками самок мышей SHR [ 19 ]. Лечение метформином не влияло на общую частоту возникновения злокачественных опухолей (). Не было случаев аденокарциномы легкого у мышей, получавших метформин в возрасте от 3 до 15 месяцев, тогда как 3 случая этой злокачественной опухоли были обнаружены в соответствующих контролях. Не было значительного различия в частоте возникновения любых других опухолей между мышами, получавшими метформин, и контрольной группой.
ОБСУЖДЕНИЕ
Мы обнаружили, что длительное лечение антидиабетическим бигуанидом метформином увеличивает среднюю продолжительность жизни самок мышей SHR, когда их начинают в молодом и среднем возрасте, но не в старости. Взятые вместе с нашими предыдущими результатами [ 9 , 10 , 18 - 21 , 24 ], мы заключаем, что лечение метформином наиболее полезно у женщин, когда оно началось относительно рано в жизни.
Метформин замедлял нарушения эстральной функции мышей независимо от возраста мышей. Таким образом, влияние метформина на эстральную функцию может быть частично диссоциировано от увеличения продолжительности жизни и профилактики рака. Примечательно, что восстановление чувствительности гипоталамуса к эстрогенам с помощью фенформина восстанавливало эстральные циклы у 16-месячных самок крыс [ 25 ]. Важно отметить, что метформин улучшает менструальную регулярность, что приводит к спонтанной овуляции у женщин с синдромом поликистозных яичников [ 26 ].
Лечение метформином не влияло на массу тела и потребление пищи, а также на метаболические и гормональные параметры, одновременно снижая температуру тела, увеличивая продолжительность жизни и задерживая рак. Эти данные противоречат представлению о том, что метформин является миметиком CR. Также было показано, что метформин и КР обладают различными метаболическими эффектами [ 27 - 29 ].
Увеличение продолжительности жизни при КР может различаться у разных видов и зависит от возраста начала заболевания. Так, Lipman et al. [ 30 ] сообщили, что CR не продлевает продолжительность жизни крыс F344xBNF1 при его инициации в позднем среднем возрасте (18 месяцев) или в пожилом возрасте (26 месяцев). Они сообщили о похожих результатах для крысиного штамма Лонг-Эванса [ 31 ]. Напротив, Dhabbi et al. [ 32 ] обнаружили, что CR увеличивает продолжительность жизни мышей B6C3F1, когда начинается в возрасте 19 месяцев. В свою очередь, Вайдрух и Уолфорд 28 ] сообщили, что CR, начатый у 12-месячных мышей, значительно продлил продолжительность жизни, но не так заметно, как при отлучении от груди. Yu et al. [57] инициировали CR у крыс в возрасте 6 недель или 6 месяцев. Было обнаружено, что когда CR ограничивался периодом быстрого роста, он не увеличивал возраст выживших 10-го процентиля. Когда CR начинался после периода быстрого роста, он был почти таким же эффективным в увеличении возраста выживших 10-го процентиля, как CR, начинающийся в возрасте 6 недель [ 33 ].
Harrison et al. [ 34 ] и Миллер и соавт. [ 35 ] изучал эффект лечения рапамицином, начатым в возрасте 9 или 20 месяцев. Два набора данных не были получены одновременно, но они представляют собой работу, выполненную с использованием одинаковых условий приготовления лекарств, рациона питания, источника воды, жилья и генетических запасов, с промежутком между датами начала только 1 год. Для самцов мышей введение рапамицина через 9 месяцев, а не через 20 месяцев, не привело к какому-либо улучшению выживаемости. Для самок мышей было высказано предположение, что лечение, начатое в возрасте 9 месяцев, может привести к некоторому незначительному снижению риска смертности в возрасте до 1000 дней, но комплексная статистическая обработка результатов не выявила какой-либо значимости различий [ 35 ].
В нашем исследовании лечение метформином не влияло на общую заболеваемость опухолью, но приводило к увеличению средней продолжительности жизни мышей с опухолями. Напротив, время обнаружения первой опухоли было в основном отложено у мышей, получавших метформин, когда такое лечение было начато рано и в среднем возрасте.
У трансгенных мышей HER-2 / neu подобное лечение метформином не изменило частоту возникновения аденокарциномы молочной железы. Однако это увеличило их задержку и уменьшило кратность [ 18 ]. Антидиабетические бигуаниды, фенформин и буформин, ингибировали спонтанный и химически индуцированный канцерогенез в ряде экспериментальных моделей [ 10 , 11 ]. Бигуаниды снижают риск карциномы молочной железы при сахарном диабете 2 типа [ 16 , 18 , 36 , 37 ].
Маркеры клеточного старения изучали в фибробластах, полученных с кожи мышей SHR 11, 16, 19 и 23 месяцев, получавших метформин с 3-го и 9-го месяцев жизни [ 38 ]. Существенные различия наблюдались между средним числом связанных со старением гетерохроматических очагов, средним значением площади ядра и интенсивностью флуоресценции ядра после окрашивания на γ-H2AX у контрольных и обработанных метформином животных. Также было показано, что метформин предотвращал накопление фибробластов с большой площадью ядер, высокую активность связанной со старением β-галактозидазы и высокую интенсивность флуоресценции после окрашивания на γ -H2AX. Следует отметить, что γ-H2AX также является маркером mTOR-зависимого клеточного старения в отсутствие повреждения ДНК [ 39 ]. Рапамицин снижает уровень γ-H2AX в стареющих клетках [ 39 ]. Кратковременное ограничение питания снижает уровни γ-H2AX, связанные с клеточным старением у мышей [ 40 ]. По-видимому, метформин задерживает накопление «старых» клеток и продлевает молодость организма.
Обсуждая недавно вмешательства позднего возраста, Flurkey et al. [ 22 ] отметил, что маловероятно, что большинство людей будут рассматривать омолаживающие процедуры, когда они молоды. В то же время большинство имеющихся данных показывают, что лечение различными лекарственными средствами, начатое у молодых грызунов, было более эффективным в продлении продолжительности жизни по сравнению с этими вмешательствами, начатыми в конце среднего или пожилого возраста 22 , 34 , 35 , 41 , 42 ]. Наши данные не являются исключением из этого правила и предполагают включение «программы старения» в раннем возрасте [ 3 , 8 ]. Реализация этой программы может зависеть от гендерных различий, как это было показано в наших экспериментах с метформином [ 21 ].
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
животные
Беспородные самки мышей SHR, полученные из Швейцарии, были приобретены на Скотном дворе «Рапполово» Российской академии медицинских наук. Мышей содержали в группах по 5-7 животных в полипропиленовых клетках (30 × 21 × 10 см) в стандартном режиме свет / темнота (12 часов света: 12 часов темноты) при 22 ± 2 ° C и получали стандартную лабораторную пищу [ 43 ] и водопроводной воды ad libitum.
Экспериментальная конструкция
Двести восемьдесят восемь самок мышей SHR находились под наблюдением. Сто двадцать девять мышей были интактны и служили контролем. Другим мышам вводили метформин (1,1-диметилбигуанид гидрохлорид, Biomedicals, Франция) с питьевой водой (100 мг / кг массы тела) ежедневно, начиная с возраста 3 месяцев (61 мышь), 9 месяцев (55 мышей) и 15 месяцев (43 мыши). Доза метформина аналогична использованной в наших более ранних экспериментах с мышами SHR, 129 / Sv или HER-2 / neu [ 10 , 18 - 21 ] и равна 300 мг / м2 площади поверхности. Пересчет для человека дает в среднем 510 мг / м2, что меньше, чем обычно используется в клинической практике у диабетиков (1,0 - 2,5 г в день). Раз в неделю всех мышей пальпировали для выявления появления опухолей молочной железы. Локализация и размеры опухолей регистрировались на специальных картах. Один раз в месяц взвешивали всех мышей и одновременно измеряли количество ежедневно потребляемой пищи (г) и воды (мл), и рассчитывали их показатели на мышь и единицу массы тела. Каждые 3 месяца влагалищные мазки животных проверяли цитологически ежедневно в течение 2 недель для оценки функции эстроза. В тот же период ректальные температуры тела мышей измеряли с помощью электронного термометра TPEM (KMIZ, Россия).
Время появления опухолей молочной железы оценивали пальпацией, а опухолевые массы измеряли штангенциркулем в двух перпендикулярных диаметрах. Постепенно растущие массы среднего диаметра> 3 мм считались опухолями. В возрасте 16,5 месяцев 10 мышей из каждой группы умерщвляли обезглавливанием после ночного голодания. Образцы сыворотки крови получали и хранили при -20 ° C для последующего метаболического и гормонального анализа. Другие животные наблюдались до их естественной гибели. Дата каждой смерти регистрировалась, и оценивалась средняя продолжительность жизни, медиана, возраст, в котором погибли 90% животных, и максимальная продолжительность жизни.
Метаболические и гормональные тесты
Уровни глюкозы в сыворотке крови оценивались ферментным колориметрическим (глюкозооксидазным) методом с наборами «Импакт» (Москва, Россия); холестерин и триглицериды - ферментативным колориметрическим методом с наборами «Ольвекс» (Санкт-Петербург, Россия); инсулин - методом иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием наборов от Diagnostic Systems Laboratories, Inc. (США).
Патоморфологическое обследование
Все животные были вскрыты. Местонахождение, количество и размер опухолей молочной железы и их метастазов в легких были проверены. Все опухоли, а также ткани и органы с подозрением на развитие опухоли иссекали и фиксировали в 10% нейтральном формалине. После обычной гистологической обработки ткани были введены в парафин. Гистологические срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали под микроскопом. Опухоли были классифицированы в соответствии с рекомендациями Международного агентства по изучению рака [ 44 ].
Статистика
Результаты эксперимента были статистически обработаны методами статистики вариаций с использованием набора статистических программ STATGRAPH. Значимость расхождений с сопоставимыми по возрасту контрольными показателями определяли в соответствии с t-критерием Стьюдента, точным методом Фишера, χ2, непараметрическим критерием Вилкоксона-Манна-Уитни и Фридмана Р. М. ANOVA по ранксам. Метод Стьюдента-Ньюмена-Кеулса использовался для всех парных множественных сравнений. Коэффициенты корреляции оценивались по методу Спирмена [ 45 ]. Различия в частоте опухолей оценивали с помощью лог-рангового критерия Мантеля-Гензеля.
Параметры модели Гомперца были оценены с использованием метода максимального правдоподобия, метод нелинейной оптимизации [ 46 ] и самописный код в «Matlab»; доверительные интервалы для параметров были получены с помощью метода начальной загрузки [ 47 ].
Для экспериментальной группы модель регрессии Кокса [ 48 ] использовали для оценки относительного риска смерти и развития опухоли при лечении по сравнению с контрольной группой.
